TurboTEV蛋白酶含有煙草蝕刻病毒（TEV） N1a蛋白催化片段的增強形式，其為半胱氨酸蛋白酶，可識別Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly的切割位點，并在Gln和Gly之間切割。TurboTEV蛋白酶是一種限制性蛋白酶，在4°C下具有很強的活性，具有高特異性和很強的穩(wěn)定性。它的活性不需要任何特殊的緩沖液，可以在最適合目標蛋白的緩沖液中使用。

TurboTEV蛋白酶是一種52 kDa的蛋白，具有GST和His標簽，因此可以很容易地通過Ni螯合或谷胱甘肽（GSH）樹脂與剪切標簽一起去除。

（一）來源及活性

來源：大腸桿菌

活性：＞10 Units/μg。1單位TurboTEV蛋白酶在30℃下1小時內(nèi)裂解3μg對照底物的85%。

（二）Protocol

1、在溶液中裂解

A、配制新鮮的冰冷透析緩沖液

透析緩沖液的一個示例：25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 - 500 mM NaCl, 14 mM β-巰基乙醇。

B、稀釋目標蛋白樣品池

（a）用透析緩沖液將目標蛋白樣品池稀釋至 1-2 mg/mL。

注意：如果目標蛋白在透析緩沖液中發(fā)生聚集，此步驟可選擇不進行。

（b）留出一小份未切割樣品用于分析。如果目標蛋白樣品池是從鎳柱上洗脫下來的，并且 EDTA 與目標蛋白兼容，則可加入 EDTA，使其最終濃度達到 0.5 mM。

C、加 TurboTEV 蛋白酶

按照蛋白酶與目標蛋白 1:100（w/w）的比例加入 TurboTEV 蛋白酶，即 100 mg目標蛋白對應(yīng) 10000 Units（1 mg）TurboTEV 蛋白酶。

D、透析

4 ℃下，用透析緩沖液透析過夜（約 16 小時）。

2、去除 TurboTEV 蛋白酶

A、上柱

3、SDS-PAGE分析（可選）

（三）產(chǎn)品應(yīng)用：

? 蛋白裂解功能；

? 從重組蛋白中去除融合標簽；

? 蛋白質(zhì)和肽的純化

（四）常見FAQ

1、問：對于TEV消化反應(yīng)，方案說明反應(yīng)在25 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl和14 mM β -巰基乙醇中進行。想知道這些緩沖液條件有多重要，是否存在以下任何一種可能會對TurboTEV的剪切效率產(chǎn)生不利影響？

(a) 1mM DTT

(b) 10%甘油

(c) 20mM組氨酸

(d) 500 mM NaCl

(e) 100mM Tris-HCl

(f) β-巰基乙醇的加入

答：

(a) 1mM的DTT就可以；

(b)不推薦使用10%的甘油；

(c)不推薦20 mM組氨酸；

(d)不建議使用500mM NaCl；

(e)不建議使用100mM Tris；

(f) β-巰基乙醇的功能與DTT類似，可以加入β-巰基乙醇。

2、問：在剪切之前，需要緩沖液交換蛋白質(zhì)嗎？

答：這可能是必要的。

（五）產(chǎn)品引用文獻

[1] Hyeok-Jin Ko, Eunhye Park, Joseph Song, Taek Ho Yang, Hee Jong Lee, Kyoung Heon Kim, and In-Geol Choi.:Functional Cell Surface Display and Controlled Secretion of Diverse Agarolytic Enzymes by Escherichia coli with a Novel Ligation-Independent Cloning Vector Based on the Autotransporter YfaL.Appl. Envir. Microbiol., May 2012; 78: 3051 - 3058.

[2] Jussi J. Joensuu, Andrew J. Conley, Michael Lienemann, Jim E. Brandle, Markus B. Linder, and Rima Menassa.:Hydrophobin Fusions for High-Level Transient Protein Expression and Purification in Nicotiana benthamiana.Plant Physiology, Feb 2010; 152: 622 - 633.

[3] Neef, Jolanda et al. “Versatile Vector Suite for the Extracytoplasmic Production and Purification of Heterologous His-Tagged Proteins in Lactococcus Lactis.” Applied Microbiology and Biotechnology 99.21 (2015): 9037–9048. PMC. Web. 9 Aug. 2017.

[4] Yoshiyuki Takatsuji,Tetsuya Haruyama,Emma Master,Maija Tenkanen, and Markus B. Linder. Structure-Function Relationships in Hydrophobins: Probing the Role of Charged Side Chains. Appl Environ Microbiol. Sep 2013; 79(18): 5533-5538.

[5] Adam B Shapiro, Ning Gao, Nichole O?Connell, Jun Hu, Jason Thresher, Rong-Fang Gu, Ross Overman, Ian M Hardern and Graham G Sproat.Quantitative investigation of the affinity of human respiratory syncytial virus phosphoprotein C-terminus binding to nucleocapsid protein.Virology Journal 2014, 11:191

[6] Alys M.Cheatle Jarvela,Lisa Brubaker,Anastasia Vedenko,Anisha Gupta,Bruce A.Armitage,Martha L.Nulyk, and Veronca F.Hinman.Modular Evolution of DNA-Binding Preference of a Tbrain Transcription Factor Provides a Mechanism for Modifying Gene Regulatory Networks. Mol Biol Evol (2014) 31 (10): 2672-2688.

[7] Jolanda Neef,Fin J.Milder,Danny G.A.M.Koedijk,Marindy Klaassens,Erik C.Heezius, Jos A.H.van Strijp,Andreas Otto,Dorte Becher,Jan Maarten van Dijl,Girbe Buist.Versatile vector suite for the extracytoplasmic production and purification of heterologous His-tagged proteins in Lactococcus lactis.Applied Microbiology and Biotechnology.Jul 2015

[8] Maarten Vercruysse,Caroline Kohrer, Bryan W.Davies,Markus F.F.Arnold,John J.Mekalanos,Uttam L.RajBhandary,Graham C.Walker. The Highly Conserved Bacterial RNase YbeY Is Essential in Vibrio cholerae, Playing a Critical Role in Virulence, Stress Regulation, and RNA Processing.PLoS Pathog. 2014 Jun; 10(6): e1004175.

[9] Yacoby, Iftach et al. “Optimized Expression and Purification for High-Activity Preparations of Algal [FeFe]-Hydrogenase.” Ed. Paul D. Riggs. PLoS ONE 7.4 (2012): e35886. PMC. Web. 6 Oct. 2015.

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