l ELISPOT 圖像分析儀（ELISPOT Reader）發(fā)展簡史

要實(shí)現(xiàn)這個過程的自動化，我們很容易想到顯微照相技術(shù)、圖像處理技術(shù)以及計算機(jī)人工智能技術(shù)。把它們綜合到一起，這就是ELISPOT圖像分析儀。1992年，德國萊卡公司推出了第一臺ELISPOT圖像分析儀。正如上世紀(jì)60年代發(fā)明的第一臺計算機(jī)占地幾百平方米，且性能低下一樣。萊卡公司推出的第一代ELISPOT圖像分析儀，僅計算機(jī)就占據(jù)一張實(shí)驗(yàn)臺的位置，數(shù)據(jù)采集部分使用了復(fù)雜的電視攝像系統(tǒng)。這臺儀器體積龐大，效率低下。在90年代初期，ELISPOT技術(shù)并未受到重視，因而ELISPOT圖像分析儀也沒有得到推廣。不到一年時間，萊卡公司就放棄了這一產(chǎn)品。1995年，隨著荷蘭Utrecht大學(xué)免疫研究所的Schielen P.（Schielen P et. al., 1995）首先引入PVDF膜到ELISPOT技術(shù)中，使得ELISPOT的可靠性和簡便性提高，ELISPOT技術(shù)逐漸受到重視，相應(yīng)的ELISPOT文獻(xiàn)大量涌現(xiàn)。眾多科研工作者迫切需要能夠自動讀ELISPOT板的設(shè)備，因此在1995年到1997年間，出現(xiàn)了數(shù)家生產(chǎn)ELISPOT圖像分析儀的廠家。

1995年出現(xiàn)的ELISPOT圖像分析儀廠家以德國卡爾蔡司公司，德國Bio-Sys公司，美國CTL公司，和德國AID公司為代表。對于如何識別PVDF膜板上的ELISPOT斑點(diǎn)，這些廠家分成兩派：1）德國卡爾蔡司公司和德國Bio-Sys公司。這兩家生產(chǎn)商延續(xù)了德國萊卡公司的思路，依然采用顯微攝像系統(tǒng)來識別ELISPOT斑點(diǎn)。這種思路保持了PVDF膜板的完整性，強(qiáng)調(diào)對每一個孔的準(zhǔn)確定位。2)德國AID公司和美國CTL公司。由于PVDF膜板在構(gòu)造上的特殊性，PVDF膜與塑料板壁之間是可撕裂的。這兩家公司從而產(chǎn)生了新的思路：采用粘貼紙將PVDF膜粘附，再將其從塑料板壁上撕下。這樣就將識別在板上的ELISPOT斑點(diǎn)的問題變成了識別在平面上的ELISPOT斑點(diǎn)的問題。而識別平面上的ELISPOT斑點(diǎn)可以直接以掃描儀來進(jìn)行。

在上個世紀(jì)90年代中期，通過掃描來進(jìn)行ELISPOT斑點(diǎn)的識別是一個重要的技術(shù)進(jìn)步。第一，掃描相對于攝像大大提高了分析速度；第二，掃描模式直接繞過了如何定位96孔板上的每一個孔的難題；第三，在價格上掃描系統(tǒng)只相當(dāng)于攝像系統(tǒng)的三分之一或者更低，從而使得大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室都能夠購買ELISPOT圖像分析儀。但是基于掃描系統(tǒng)的ELISPOT圖像分析儀也有其固有的缺點(diǎn)。首先，掃描儀的分辨率非常低，隨著ELISPOT檢測方法應(yīng)用范圍迅速擴(kuò)大，某些實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生的ELISPOT斑點(diǎn)很小，掃描儀完全無法識別。雖然掃描儀本身的分辨率也在不斷提高，但和顯微攝像系統(tǒng)相比，始終要低1-2個數(shù)量級。其次，將PVDF膜板底部的PVDF膜撕下來掃描的做法是有其不妥之處：某些時候直接導(dǎo)致部分結(jié)果丟失，同時也不利于數(shù)據(jù)長期保存。第三，其應(yīng)用受限于以膜為底的ELISPOT板，當(dāng)90年代末期，ELISPOT透明塑料板出現(xiàn)時，這種基于掃描的ELISPOT圖像分析儀在應(yīng)用上大大受阻。

在ELISPOT圖像分析儀的發(fā)展史上，90年代末期出現(xiàn)的數(shù)碼技術(shù)是重要的技術(shù)進(jìn)步。數(shù)碼識別技術(shù)與計算機(jī)人工智能的結(jié)合使得體積小、功能強(qiáng)大的ELISPOT圖像分析儀成為可能。當(dāng)數(shù)碼技術(shù)出現(xiàn)以后，德國AID公司和美國CTL公司迅速拋棄了其原有的基于掃描系統(tǒng)的ELISPOT圖像分析儀，重新投向以攝像系統(tǒng)為基礎(chǔ)的ELISPOT圖像分析儀。在今天的ELISPOT圖像分析儀市場上，ELISPOT掃描系統(tǒng)只剩下部分90年代的庫存產(chǎn)品。這就是技術(shù)進(jìn)步的重大力量。

由于數(shù)碼識別技術(shù)的出現(xiàn)，始終堅持通過顯微攝像識別ELISPOT斑點(diǎn)這一技術(shù)路線的德國卡爾蔡司公司和德國Bio-Sys公司從此一直走在ELISPOT圖像分析儀市場的前端。在具體的技術(shù)路線上，兩家公司又略有不同。德國卡爾蔡司公司希望突出其高精密的顯微鏡頭，力求在成像上做到能夠識別PVDF膜上的每一個小的斑點(diǎn)。但是其缺陷也非常明顯：第一，要達(dá)到此目的，只能通過放大圖像來實(shí)現(xiàn)，這樣就不可能在一副圖像上包括整個完整孔底。卡爾蔡司公司通過軟件拼接的方法，將多幅放大圖像拼成一幅包括大部分孔底的圖像，從而實(shí)現(xiàn)對整個孔中的ELISPOT斑點(diǎn)進(jìn)行計數(shù)。這樣的結(jié)果是：圖像出現(xiàn)明顯的拼接痕跡，同時，在拼接縫部分的斑點(diǎn)識別，以及在孔邊緣的斑點(diǎn)識別也都同時成為了亟待解決確又難以解決的問題。第二，更關(guān)鍵的是，由于ELISPOT實(shí)驗(yàn)過程涉及細(xì)胞，細(xì)胞碎片、自發(fā)分泌、非特異分泌、顯色問題等多種情況，都會在PVDF膜上留下斑點(diǎn)或者花紋。因此，ELISPOT斑點(diǎn)識別的一個關(guān)鍵的問題是對真假斑點(diǎn)的識別。熟悉ELISPOT技術(shù)的實(shí)驗(yàn)者都有共識，一個正常的ELISPOT斑點(diǎn)在大小上通常不會小于20μm。因此，關(guān)注于對小的斑點(diǎn)都能清晰識別，在生物學(xué)上并沒有太大的實(shí)際意義，反而因?yàn)樵黾恿诵“唿c(diǎn)的識別影響了對真正的ELISPOT斑點(diǎn)的識別。第三，也是不可忽視的一點(diǎn)：卡爾蔡司公司的ELISPOT圖像分析儀是市場上價格昂貴的設(shè)備，是其他廠商同類型設(shè)備的兩倍以上！

l 德國ByoSys公司的Bio-Reader系列

德國Bio-Sys公司從上世紀(jì)80年代開始就致力于生物圖像識別領(lǐng)域，在進(jìn)入ELISPOT圖像分析儀市場后一直以其先進(jìn)的ELISPOT斑點(diǎn)識別技術(shù)聞名。德國Bio-Sys公司首先解決了顯微攝像系統(tǒng)難以定位96孔板上的每一個孔的問題。其解決方法基于圖像識別技術(shù)，利用板孔邊壁和真正的孔底的細(xì)微差別，在機(jī)械定位的基礎(chǔ)上，通過軟件識別來進(jìn)一步提高每孔的定位精度。是目前市場上所有ELISPOT圖像分析儀中唯一能夠完整識別整個孔底ELISPOT斑點(diǎn)圖像的設(shè)備。在對真假斑點(diǎn)的分辨中，德國Bio-Sys公司除了具備完善的物理學(xué)多參數(shù)識別技術(shù)，還特別針對ELISPOT斑點(diǎn)形成的生物學(xué)過程，通過細(xì)胞因子顯色后的“光密度”峰值積分分析方法，精確分辨真假斑點(diǎn)、融合斑點(diǎn)等復(fù)雜情況。Bioreader系列ELISPOT圖像分析儀國外大多數(shù)較有經(jīng)驗(yàn)的ELISPOT實(shí)驗(yàn)室推崇的特點(diǎn)為：專業(yè)性和參數(shù)全開放性。因?yàn)镋LISPOT實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性，ELISPOT斑點(diǎn)形成在不同的實(shí)驗(yàn)條件下有非常大的差異。這就對ELISPOT圖像分析儀提出了較高的要求：既要能夠保證斑點(diǎn)計數(shù)的真實(shí)性和一致性，又要能夠根據(jù)不同情況，通過實(shí)驗(yàn)者的判斷來校正儀器對ELISPOT斑點(diǎn)識別的標(biāo)準(zhǔn)。要同時實(shí)現(xiàn)以上兩個要求，唯一的辦法是將儀器的所有判斷標(biāo)準(zhǔn)向ELISPOT實(shí)驗(yàn)者開放，實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)者和儀器的互動。在這一方面，德國Bio-Sys公司始終走在ELISPOT斑點(diǎn)識別領(lǐng)域的前列，新的Bioreader-4000型（圖8.3）和Bioreader -5000（圖8.4） 型在專業(yè)性和適用性方面都領(lǐng)先于其他廠家的設(shè)備。

l ELISPOT 圖像分析儀的發(fā)展和展望

近幾年，ELISPOT圖像分析儀的應(yīng)用在向兩個方向發(fā)展。

第一， 作為斑點(diǎn)識別類型的儀器，ELISPOT圖像分析儀在努力地開辟在其它斑點(diǎn)識別領(lǐng)域的應(yīng)用。

在這個方面做的較好的是德國Bio-Sys公司的Bioreader系列。受惠于Bioreader在光源照明設(shè)計和軟件參數(shù)開放兩方面的優(yōu)點(diǎn)，德國Bio-Sys公司的ELISPOT圖像分析儀只需在參數(shù)上進(jìn)行調(diào)整，就可以對6孔板、24孔板、96孔板等板型上的病毒斑、溶血空斑、腫瘤細(xì)胞克隆斑等實(shí)體斑點(diǎn)或者空斑點(diǎn)進(jìn)行識別，大大擴(kuò)展了儀器本身的應(yīng)用。

第二， 對雙色、多色、以及熒光FluoroSpot的識別。

隨著ELISPOT技術(shù)本身的發(fā)展，研究者不再滿足于現(xiàn)有的對單一細(xì)胞因子分泌所形成的ELISPOT斑點(diǎn)的識別。雙色或多色ELISPOT技術(shù)就此產(chǎn)生。簡而言之，雙色或多色ELISPOT即檢測同一細(xì)胞同時分泌兩種或以上的細(xì)胞因子的技術(shù)。舉個例子，如果以紅色顯色劑顯示IFN-γ的分泌，以藍(lán)色顯色劑顯示IL-2的分泌，在同一個孔中，就可以通過這兩個顯色系統(tǒng)分辨：有多少細(xì)胞只分泌IFN-γ（紅色斑點(diǎn)），只分泌IL-2（藍(lán)色斑點(diǎn)），和同時分泌這兩種細(xì)胞因子（棕色斑點(diǎn)）。

但是，原理上很簡單的雙色或多色ELISPOT技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中遇到了很大的困擾。這就是關(guān)于混色ELISPOT斑點(diǎn)的識別問題。具體到每個細(xì)胞，如果有兩個顯色系統(tǒng)同時顯色：部分紅色/部分藍(lán)色，以及其間的各種組合，都會導(dǎo)致不同的顏色；斑點(diǎn)的不同顯色區(qū)域，可能以紅色為主，也可能以藍(lán)色為主，無法均一定義；先分泌某種細(xì)胞因子，后分泌某種細(xì)胞因子，可能會產(chǎn)生覆蓋等諸多問題。這些問題都導(dǎo)致混色ELISPOT斑點(diǎn)難于識別。在這個方面，目前還沒有一個很好的解決辦法，從而也限制了雙色或多色ELISPOT技術(shù)的應(yīng)用。從實(shí)際使用中來看，有少部分科研工作者在使用雙色ELISPOT技術(shù)，通常為探索性的研究；而多色ELISPOT技術(shù)，幾乎沒有人使用。

與之相對應(yīng)，ELISPOT圖像分析儀在這個方面也只是具備基本的功能。大多數(shù)ELISPOT圖像分析儀采用RGB（紅、綠、藍(lán)）三色定義方案來識別多色斑點(diǎn)。RGB三色定義方案采用固定紅、綠、藍(lán)濾鏡，通過對一種顏色斑點(diǎn)的遮蓋來識別其他所有顏色斑點(diǎn)。從理論上講，在情況下多能夠識別三色斑點(diǎn)的ELISPOT。但實(shí)際應(yīng)用中，顯色系統(tǒng)的不同實(shí)驗(yàn)條件會導(dǎo)致不同的顏色。比如：AEC顯色系統(tǒng)從理論上為標(biāo)準(zhǔn)紅色，但實(shí)際上根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件的不同，其顯色從橙黃到正紅到紫紅。其他顯色系統(tǒng)也有類似的問題。如果兩種或以上顯色系統(tǒng)共同作用，其混色斑點(diǎn)的顏色千變?nèi)f化，絕對不是簡單用紅、綠、藍(lán)三色固定濾鏡能夠分辨的。如何解決這個問題，只有在顏色定義方案上下功夫，在這個方面，德國Bio-Sys公司的顏色解決方案相對較好。德國Bio-Sys公司采用HLS（色度、亮度、飽和度）這一國際新的顏色定義方案，理論上可自定義十萬種以上顏色，用于濾鏡識別。在針對單色顯色系統(tǒng)和多色顯色系統(tǒng)因各種原因?qū)е路菢?biāo)準(zhǔn)顏色的識別上相對準(zhǔn)確。當(dāng)然該系統(tǒng)也有其自身的不足：對于斑點(diǎn)與斑點(diǎn)之間、孔與孔之間、板與板之間的顏色變化，不能自動適應(yīng)，自動調(diào)節(jié)。對于顏色自動識別，這是一個普遍的難題，目前沒有一種技術(shù)能夠做到。

ELISPOT技術(shù)如果需要向多細(xì)胞因子檢測的方向發(fā)展，就必須解決多顯色系統(tǒng)同時顯色的問題。既然混色識別是一個難以跨越的難題，一些ELISPOT試劑生產(chǎn)商自然向熒光顯色方向發(fā)展，這就是熒光耦聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（FluoroSpot）。由于采用熒光發(fā)光標(biāo)記，而不是顯色劑沉淀顯色，熒光耦聯(lián)免疫斑點(diǎn)（FluoroSpot）從誕生之日起，就天然的解決了多系統(tǒng)同時顯色的問題。同時由于熒光發(fā)射光波長具有唯一性，其顏色不因?qū)嶒?yàn)條件的變化而變化。FluoroSpot從2005年出現(xiàn)以來，在敏感性、特異性等方面已經(jīng)達(dá)到或超過ELISPOT，目前更大的難題在于長期保存的問題，限制了其商業(yè)化進(jìn)程。但是，F(xiàn)luoroSpot作為多細(xì)胞因子檢測的必然發(fā)展方向，已經(jīng)在ELISPOT領(lǐng)域的科學(xué)工作者中達(dá)到共識。與之相配合，熒光耦聯(lián)免疫斑點(diǎn)（FluoroSpot）圖像分析儀也在2005年底首先由德國Bio-Sys公司正式推出市場，并在加拿大實(shí)現(xiàn)全世界首臺FluoroSpot圖像分析儀的銷售和應(yīng)用。

我們可以預(yù)測，隨著FluoroSpot技術(shù)的成熟和FluoroSpot圖像分析儀的成熟，F(xiàn)luoroSpot必然逐漸取代目前的ELISPOT技術(shù)，并使得免疫斑點(diǎn)技術(shù)真正成為以高通量、多因子、高靈敏、和高穩(wěn)定性為特征的細(xì)胞免疫檢測技術(shù)。而免疫斑點(diǎn)圖像分析儀的不斷發(fā)展也大力地推動了該技術(shù)在免疫學(xué)、病毒學(xué)、腫瘤學(xué)、以及臨床檢測中的廣泛應(yīng)用。